常见引物 Tm 目标
许多常规 PCR 引物长度为 18 到 30 nt，GC 含量为 40% 到 60%，且正反向引物 Tm 尽量接近。具体目标取决于聚合酶、缓冲液、扩增片段和实验流程。
DNA 熔解温度计算器
估算短寡核苷酸或 PCR 引物的 Tm、GC 百分比、序列长度和设计风险提示。
DNA 熔解温度公式
Wallace Tm = 2(A + T) + 4(G + C)短引物可用 Wallace 规则根据碱基组成快速估算 Tm。盐校正近似会进一步考虑序列长度和离子强度，对较长寡核苷酸更有参考意义。
| Symbol | Variable | Description |
|---|---|---|
| A/T/G/C | 碱基数量 | 输入 DNA 序列中各碱基的数量。 |
| GC% | GC 含量 | G 和 C 在序列中的百分比。 |
| Tm | 熔解温度 | 模型条件下约一半双链解离的温度。 |
如何使用 DNA Tm 计算器
- 1
粘贴 DNA 序列
只使用 A、T、G、C，空格和换行会被忽略。
- 2
设置盐浓度
一般 PCR 风格估算可先使用 50 mM。
- 3
查看 Tm 和 GC
判断序列的 Tm、GC 含量和长度是否适合你的应用。
何时使用更高级工具
如果实验很关键、序列较长、盐/Mg/dNTP 条件重要，或需要检查发卡和引物二聚体，应使用 nearest-neighbor 寡核苷酸分析工具。
实用检查项
Tm 估算最好与序列质量检查一起使用。
- 避免长串单一碱基。
- 配对引物 Tm 尽量相差不超过约 3 °C。
- 检查 3' 端互补性。
- 用比对或设计软件确认产物特异性。